肠旁路术后GK大鼠消化吸收功能变化情况与其对血糖血脂的影响.pdf

福建医科大学硕士学位论文 1 附录 中英文对照 英文缩写 英文全称 中文全称 T2DM Type 2 diabetes mellitus 2型糖尿病 GK Goto-Kakizaki 非肥胖性 2 型糖尿病模型 DJB Duodenal-jejunal bypass 十二指肠 -空肠转流术 NBPD New Billiopancreatic diversion 改良胆胰转流术 OGTT Oral glucose tolerance test 口服糖耐量试验 FFA Free fatty acid 游离脂肪酸 TG Triglyceride 甘油三酯 CH Cholesterol 胆固醇 FPG Fasting Plasma glucose 空腹血糖 RBG Random blood glucose 随机 血糖 AUC Area under the curve 曲线下面积 GLP-1 Glucagon-like peptide-1 胰高血糖素样肽 -1 GIP Gastric Inhibitory Polypeptide 葡萄糖依赖性胰岛素释放肽 IDF International Diabetes Federation 国际糖尿病协会 福建医科大学硕士学位论文 2 肠旁路术后 GK 大鼠消化吸收功能 变化情况 及其对血糖血脂的影响 摘 要 【目的】 研究 肠旁路术（ Duodenal-jejunal bypass, DJB） 后非肥胖型 2 型糖尿病（ Goto-Kakizaki, GK） 大鼠 消化吸收功能变化情况及其对 血糖 、 血脂的影响 。 同时和 改良胆胰转流术（ New Billiopancreatic diversion, NBPD） 组及假手术组进行对比研究，观察三组 GK 大鼠 葡萄糖 、 淀粉 、 蛋清灌胃 后血糖变化 及正常饮食后 ，血糖血脂的变化情况，探讨外 科 手术治疗 2 型糖尿可能的 机制。 【方法】 1． 15 周龄雄性 GK 大鼠 30 只，依据体重完全随机分为三组，分别行十二指肠 -空肠转流术（ DJB 组 10 只）、改良胆胰转流术（ NBPD 组 10 只）、假手术组（ SHAM组 10 只）。 2． 术前 1 周 ， 术后 1、 2、 4、 6 周检测空腹体重 ； 术前 2 周 ， 术后 2、 4、 6 周检测 空腹血糖 （ FPG）和随机血糖 （ RBG） 。 3． 术前 2 周术后 2、 4、 6 周，做 口服糖耐量试验（ OGTT）。 4． 术前 2 周及术后 6 周，测空腹及餐后 2h 血脂。 5． 分别于术后第 42、 43 天，使用 50%葡萄糖和红薯淀粉按照 8kcal/kg 的热量进行灌胃，尾静脉采血测 0、 30、 60、 120、 180min 血糖，并计算曲线下面积 (AUC)。 6． 术后第 46 天，使用蛋清按照 8kcal/kg 的热量进行灌胃，然后测 0， 30， 60， 120， 180min 血糖值，计算出血糖曲线下面积 (AUC)。 【结果】 1． 术前，三组大鼠空腹体重差异均无统 计学意义。术后 1 周，三组大鼠体重低于术前 ， 差异有统计学意义。 术后 2、 4、 6 周三组大鼠空腹体重 差异无统计学意义。术前 2 周，及术后 2、 4、 6 周三组 GK 大鼠空腹血糖之间差异均无统计学意义。术后 2、 4、 6 周， DJB 组和 NBPD 组随机血糖 低于假手术组， 术后 2、 6 周 DJB组 、 NBPD 组和术前相比，差异有统计学意义， 在术后 6 周， NBPD 组和假手术 组差异有统计学意义。 2． 术前 2 周 ， 三组大鼠之间 OGTT 血糖曲线下面积 差异 无统计学意义，术后 2、 4、福建医科大学硕士学位论文 3 6 周， DJB 组和 NBPD 组 OGTT 血糖曲线下面积明显小于假手术组，在术后 4、 6周， NBPD 组 OGTT 血糖曲线下面积和假手术之间 差异 有统计学 意义 。 3． 术前 2 周，三组大鼠之间空腹及餐后 2h 胆固醇，甘油三酯，游离脂肪酸无差异 。 在术后 6 周， DJB 组 、 NBPD 组空腹胆固醇 、 游离脂肪酸和假手术相比，差异具有统计学意义， DJB 组餐后 2h 胆固醇 、 游离脂肪酸和假手术组及术前相比，差异有统计学意义。 4． 使用淀粉和葡萄糖灌胃后， DJB 和 NBPD 组血糖曲线下面积都明显低于假手术组，两种物质灌胃后 NBPD 组血糖曲线下面积和假手术相比，差异均统计学意义。 DJB 组和 NBPD 组 淀粉灌胃后 30、 60、 120min 血糖值及血糖曲线下面积均小于葡萄糖灌胃的值。 5． 蛋清灌胃后 ，三组大鼠血糖值稍微波动， 血糖 曲线下面积差异无统计学意义。 【结论】 1.肠旁路术 （ DJB） 、 改良胆胰转流术（ NBPD）都能改善 GK大鼠血糖。 2. DJB术 和 NBPD术后 ， 都改善 GK大鼠血脂。 3. DJB术 和 NBPD术后， GK大鼠 消化吸收功能的变化，和胆胰液的转流有关，这可能是改善血糖血脂的主要机制之一。 【关键词】 GK 大鼠， 肠旁路术 ，改良胆胰转流术，血糖 ，血脂 福建医科大学硕士学位论文 4 The changes of Digestion and absorption function and its effect on GK rats blood glucose and lipids after Duodenal-jejunal bypass Abstract Objective To oberve the changes of Digestion and absorption function and its effect on GK rats blood glucose and lipids after Duodenal-jejunal bypass, at the same time, To make a comparison with New Billiopancreatic diversion surgery( NBPD) group and sham surgery group to observe the blood glucose after lavaging glucose， sweet potato, egg whites， and to observe Fasting and 2-hour Postprandial blood lipid changes of the three groups rats and to explore the possible mechanisms involoved of operation treat type 2 diabetes. Methods 1. Thirty 12-week-old male GK rats According to the weight were randomized into three groups: respectively Undergoing Duodenal-jejunal bypass surgery (DJB group, n=10), New Billiopancreatic diversion surgery (NBPD group, n=10) ,sham operation(SHAM group ,n=10). 2. Each group of GK rats, Body weight were detected 1week before surgery and1, 2, 4, 6 weeks after surgery in the fasting state and fasting plasma glucose (FPG), Random blood sugar were measured 2 week before surgery and2, 4, 6 weeks after surgery . 3. Oral glucose tolerance test (OGTT)were determined in 2 week before surgery and 2, 4, 6 weeks after surgery . 4. Fasting and 2-hour Postprandial Free fatty acid, Triglyceride, Cholesterol were determined before2 week surgery and 6 weeks after surgery. 5. 42 and 43 days after Surgery, using 50% glucose and sweet potato starch according to the 8 kcal/kg of quantity of heat to gavage, testing caudal vein blood at 0, 30, 60, 120, 180 min, and calculating the area under the curve (AUC) of blood glucose. 6. Postoperation 46 day, using egg whites lavage in accordance with the quantity of heat 福建医科大学硕士学位论文 5 of 8 kcal/kg, then to test 0, 30, 60, 120, 180 min blood glucose levels,to calculate the area under the curve (AUC) of blood glucose. Results 1.pre-operation, three groups of rats no statistically significant difference were observed in body weight, 1 weeks after surgery, three groups of rats weight is lower than the pre-operation and there was statistically significant difference. 2, 4, 6weeks after surgery, there was no statistically significant difference between groups of rats. 2 week before surgery, and postoperative 2, 4, 6 groups of GK rats there were no statistically significant difference between fasting blood glucose. 2, 4, 6 weeks postoperatively, DJB group and NBPD group random blood glucose were lower than the sham group. 2, 6 weeks after surgery NBPD group and DJB group random blood glucose compared with sham operation group and preoperative, difference was statistically significant.6 weeks after surgery, NBPD group random blood glucose compared with sham operation group ,difference was statistically significant. 2. preoperative OGTT, three groups rats of blood glucose area under the curve no statistical significance. 2, 4, 6 weeks after surgery, DJB group and NBPD group blood glucose area under the curve were significantly less than control group. 4, 6 weeks after surgery, NBPD group glucose area under the curv was statistically difference with sham surgery group. 3.2 week Before surgery, three groups rats fasting and postprandial 2h free fatty acids ,cholesterol, triglycerides have no difference. 6 week after surgery, DJB group, NBPD group fasting cholesterol, free fatty acids compared with control, difference is statistically significant. DJB group postprandial 2h cholesterol， free fatty acids compared with control and pre-operation， difference is statistically significant. 4. Using sweet potato starch and glucose lavage , DJB group and NBPD group blood glucose area under the curve were lower than the sham group, both of the substances after lavage ,NBPD group area under the curve compared with sham group, the differences were statistically significant. after Using starch lavage, DJB group and NBPD group 30, 60, 120 min blood glucose and blood glucose area under the curve are lower then Using glucose lavage. 福建医科大学硕士学位论文 6 5. After egg white lavaging, three groups GK rats slightly fluctuations in blood glucose levels, no statistical difference was found between groups of blood glucose area under the curve. Conclusion 1. Both Duodenal-jejunal bypass (DJB) surgery and New Billiopancreatic diversion (NBPD)surgery, can improved GK rats blood glucose . 2. Both DJB surgery and NBPD surgery, can improved GK rats blood lipids . 3.GK rats After DJB surgery and NBPD surgery, The changes of digestion and absorption function are closely related with Billiopancreatic diversion, This may be one of the main mechanisms to improve blood glucose, blood lipids. Key Words GK rats, Duodenal-jejunal bypass surgery, New Billiopancreatic diversion surgery,blood glucose, blood lipid 福建医科大学硕士学位论文 7 前 言 近年来，随着生活水平的提高 以及生活方式的改变 ，我国 糖尿病 患 病率逐年上升 ， 其中 2 型糖尿病 （ Type 2 diabetes mellitus, T2DM） 的 患病率约占 90%以上。以前 糖尿病的主要治疗方法是内科治疗， 包括 医学营养治疗 、 体育锻炼 、口服降糖药物、 注射 胰岛素等，但治疗糖尿病的效果不是特别理想， 都 只能延缓 其 发展，不能从根本上治愈 2 型糖尿病 。 自从 20 世纪 80 年代 偶然发现 外科手术对 T2DM的控制有独特的作用， 慢慢提出了 外科 手术 干预治疗 T2DM 的理念，为 T2DM 的治疗开辟了一条新的道路 [1]。 经 过几十年的发展， 到目前为止，用于治疗糖尿病的胃肠外科 手术方式已发展有数十种 ， 临床上用于治疗 肥胖型及 2 型糖尿病的手术方式主要有胃旁路术（ Gastric bypass, GBP）（ 见图 1）和胆胰液转流术（ Biliopancreatic Diversion, BPD）等 。 近年来， 治疗非肥胖 型 2 型糖尿病患者的 肠旁路术 (Duodenal-jejunal bypass, DJB)（ 如图 2） 也 广泛 应用于临床。 由于 该 术式 无 胃大部切除，术后并发症较少 ， 对 非肥胖型 2 型糖尿病 (Goto-Kakizaki , GK)大鼠降糖效果也 较好 ， 因此 在 使用动物进行外科手术治疗 2 型糖尿病机制研究 中 也 得到了广泛的应用 。 图 1 GBP 示意图 图 2 DJB 示意图 虽然手术治疗 2型糖尿病的效果良好，而且 2011国际糖尿病协会（ International Diabetes Federation, IDF）正式承认 外科 手术作为治疗 2型糖尿病的一种方法，但其确切 机制并不明确。目前，关于 外科手术 治疗 2型糖尿病的机制，有肠道激素假说，炎症因子以及氧化应激假说，脂肪因子作 用，肠道内糖异 生作用，胆酸作用，迷走神经作用，以及消化吸收作用等假说 ，但 多数学者认为术后胃肠道激素的改变，是改善 2型糖尿病患者血糖的主要因素 [2] [3]，并据此提出了肠道激素假说， 即 前肠福建医科大学硕士学位论文 8 假说和后肠假说 [4] [5]， 目前大部分学者更 倾向于后肠假说。前肠假说认为手术后 ，由于肠道 旷置， 减少或停止了食物对十二指肠和近端小肠的刺激，从而使得上段空肠壁上 K细胞释放 葡萄糖依赖性胰岛素释放肽 (Gastric Inhibitory Polypeptide, GIP)减少，进而解除了胰岛素抵抗； 后肠假说提出了术后未完全消化 的食物提前刺激肠道 L 细胞，增加胰高血糖素样肽 -1（ Glucagon Like Peptide-1, GLP-1）的分泌，从而起到改善血糖的作用。 GIP是一种由十二指肠和 上段 空肠的 K细胞分泌的肠激素，主要功能是促进胰岛 B细胞分泌胰岛素，胰高血糖素分泌、抑制胃排空及胃酸分泌。有研究显示 6782型糖尿病的发生主要是因为 未完全消化的食物，尤其是葡萄糖和脂肪，在通过十二指肠和近端空肠时 刺激 K细胞，导致 GIP分泌增多，进而刺激胰岛素过度的分泌，引起外周组织对胰岛素敏感性降低，导致胰岛素抵抗，引起血糖增高。 而和后肠假说有关的 GLP-1主要由末端回肠 L细胞分泌，它具有促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖分泌、抑制胃酸分泌和 延迟胃排空 、 减少食物摄入，降低体重 、降低心脑血管的发病率和死亡率等作用 [9] [10] [11]。此外， GLP-1还能增加靶器官或组织的胰岛素敏感性 ，增加 B细胞数量，增强其功能，促进胰岛新生 [12]。根据肠道 激素 假说理论， DJB术后 肠道解剖结构的改变 导致 肠激素 GIP和 GLP-1分泌 的 变化 ，是改善术后血糖的主要原因。 尽管 肠道假说的解释有其合理性， 肠道激素（ GLP-1）的降糖效果 也 不可否认，像 GLP-1 类似物如 利拉鲁肽也 已经在临床上应用治疗 2型糖尿病患者，并且起到了良好的降糖效果，但仅仅用术后激素的改变来完全解释 外科 手术治疗 2型糖尿病的机制，很有局限性 。 具体的机制，尚需进一步研究 。 我们先前的研究 发现，改良胆胰转流术（ New Biliopancreatic Diversion， NBPD 见图 3， 该术式仅为实验研究设计， 目前 在临床上没有应用） 与 DJB术 相比， 只有胆胰液的转流， 并无消化道旷置 ， 也能改善 2型糖尿病大鼠的血糖。 该术式后， 食物没有提前进入回肠末端刺激 L细胞分泌 GLP-1，也没有 减少或停止对十二指肠 和近端小肠的刺激而影响上段空肠壁上 K细胞释放 GIP， 因此 ，用肠道 激素 假说 完全解释 DJB术 后降糖效果，显然 无法 令人 完全 信服。 NBPD术后，仅有胆胰液转流，改 变了原来胆胰液排放到肠内的路径，延迟食物和胆汁及胰液混合的时间，下移胆胰液和食物混合的 位置， 也能改善 GK大鼠的血糖和糖耐量 [13] [14] [15] 。那么其主要机制是什么呢？ 众所周知， 胆 胰液是 最重要的 消化液 ，在食物消化吸收过程中起着至关重要福建医科大学硕士学位论文 9 的作用。 在胆 胰液中 主要是 由 腺泡细胞分泌的消化三种营养物质 消化酶 ， 主要有胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶原和糜蛋白酶原 。胰淀粉酶 可将 淀粉水解 为麦 芽糖及葡萄糖。胰脂肪酶 可使 甘油三酯 分解 为脂肪酸、甘油一酯和甘油。 胰蛋白酶和糜蛋白酶都能分解蛋白质，二者共同作用时，蛋白质 能被 分解为小分子的多肽 和氨基酸。 另外，胆胰液中 肝细胞 和胆管细胞 分泌的胆汁 ，对脂肪的消化吸收 也同样起到很重要的作用。胆汁中含有 胆盐、胆固醇和卵磷脂等 ， 可降低脂肪的表面张力，使脂肪乳化成许多微滴， 从而增加胰脂肪酶的作用面积，提高消化效率 。同时， 胆盐还可与脂肪酸等结合，形成水溶性复合物， 促进脂肪酸在肠道内的吸收 。 由此可见， 胆胰液对食物的消化吸收有重要影响 ， 因此 改变 胆胰液 和食物混合时间及混合位置 ， 可能会影响各种营养物质 的消化吸收 。 相比于 DJB术 ， NBPD术 没有肠道旷置， 只有胆胰液转流， 从解剖上 讲， 只是将 胆胰液管从原来与十二指肠汇合，改到了和空肠汇合， 胆胰 液排放到肠道的路径 改变 ，导致胆胰液和食物混合时间延迟，以及位置下移。 这 两种术式 都可改善 GK大鼠 血糖，这 提示，胆胰液的转流， 可能 导致食物消化吸收的改变，这可能 是 DJB术 及 NBPD术后 改善 2型糖尿病大鼠血糖的主要机制之一。 那么， DJB术及 NBPD术后，胆胰 液的转流，会对营养物质消化吸收产生怎样的影响，从而改善术后血糖 的呢？ 本实验将 GK大鼠 分为三组， 分别行 DJB术， NBPD术 和假手术后 ， 使用 淀粉 、葡萄糖 、 蛋 清 灌胃 ， 检测血糖 变化情况；检测术前及术后血脂 变化情况 ， 来探讨DJB术后 GK大鼠消化吸收功能的变化情况及其对血糖血脂的影响 ， 进一步探讨DJB术治疗 2型糖尿病的机制。 图 3 NBPD示意图 福建医科大学硕士学位论文 10 材料与方法 1 材料 1.1 实验动物 于上海斯莱克实验动物有限责任公司购入 12周龄 SPF 级雄性 GK大鼠 50只，实验动物许可证号码 SCXK(沪 )2012-0002，体重 250-300g/只，饲养于福建医科大学腹部外科研究所实验动物房。 1.2 主要实验试剂 0.9%氯化钠注射液 辰欣药业股份有限公司 硫酸庆大霉素注射液 2ml/8 万 u 福州海王福药有限公司 肝素 南 京新百药业有限公司 碘伏 广州庆丰消毒制品有限公司 75%酒精 福建汇正药业有限公司 20ml装 50%葡萄糖口服 湖北科伦药业有限公司 红薯 淀粉 福州惠万家食品有限公司 鸡蛋 福州鑫宏兴蛋业有限公司 吸入性七氟烷 上海恒瑞医药有限公司 双蒸水 福建医科大学附属第一医院 水合氯醛 福建医科大学附属第一医院 1.3 主要实验仪器及设备 高压消毒锅 上海三申医疗器械有限公司 普通台式低温离心机 （ TGL-20M） 长沙 平凡仪器仪表有限公司 台式电子秤 上海乾峰电子仪器有限公司 显微手 术器械 宁波成和显微器械厂 动物手术台 福建省腹部外科研究所 4-0非吸收缝线 美国 强生公司 6-0， 8-0无损伤带线缝合针 宁波成和显微器械厂 罗氏活力型一键式微量血糖仪 罗氏公司 罗氏罗康全活力型血糖试纸 罗氏公司