放线菌I03A-02842的筛选、活性产物的分离纯化以与Sansanmycins次要组分的分析.pdf

前言前言结核病是结核杆菌引起的慢性传染病“1，是人类发展史上长期困扰人类的病患之一。其中最常见的肺结核病，在我国俗称“痨病”，是由结核分枝杆菌通过空气传播所致。但是上世纪40年代，特别是有效抗结核药物链霉素的出现，结核病的化学治疗(简称化疗)成为了人类控制结核病的主要手段，结核病的控制也有了划时代的改变，全球结核病病情由此得以迅速下降。对氨基水杨酸被应用于临床后发现，链霉素联合对氨基水杨酸的治疗效果优于单一用药，而且可以防止结核分枝杆菌产生耐药性。异烟肼发现后，产生了著名的结核病标准化疗方案，即链霉素+异烟肼+对氨基水杨酸，疗程18个月--24个月，并可根据药品和患者的耐受性将对氨基水杨酸替换为乙胺丁醇或氨硫脲，俗称“老三化”。上世纪70年代随着利福平在临床上的应用及对吡嗪酰胺的重新认识，在经过大量的实验后，短程化疗成为结核病治疗的最大热点，并取得了令人瞩目的成就。1。由于人类社会抗生素的滥用，结核病自身的特点以及认为其基本已经消灭的错误认识，在过去的几十年中对抗结核病药物的研发严重滞后，几乎没有新型的药物问世阱。据世界卫生组织统计“‘“，目前约有占世界1／3的人口感染过结核菌，全世界现有结核病人约2000万，每年新发病800万一1000万人，死亡约200万人，超过了艾滋病、疟疾、腹泻等传染病死亡人数的总和。相当一部分结核病病人感染的结核菌对传统的抗结核药物产生耐药性。我国结核病疫情也呈蔓延趋势，2000年进行的第四次全国结核病流行病学抽样调查结果显示。‘”，我国有4亿一5亿人受到过结核分枝杆菌的感染，有各类肺结核病人约800万，每年死于结核病的人数达13万，为各类其它传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。我国结核病的流行具有患病率高、耐药率高等特点，为全球结核病高负担国家之一。造成结核病发病率大规模回升的主要原因有：①长期以来结核病作为被认为已经被消灭的流行病而为人类所忽视，许多国家缺少统一的防治计划来控制该病的蔓延，许多病人没有接受彻底治疗，导致结核病复发并形成耐药性；②结核病与艾滋病双重流行。2007年4月美国《自然免疫学报》报道：印度研究者在人体内发现EAsT一6蛋白质，与体内巨噬细胞结合，能直接破坏人体的免疫系统，是结核病重要的发病原因之一。当人年迈、衰弱或免疫机制受损时，前言结核杆菌的潜伏者约有10％就发展成活动性结核。人免疫缺陷病毒感染是其激发的重要因素，艾滋病病人感染结核的可能性比一般人高30一50倍，同时艾滋病病人一旦感染结核更易发展为活动性的、有传染性的结核病人，进而威胁周围的健康人群；③都市的发展，环境的破坏，移民、难民以及全球旅游者的急剧增加。目前结核病治疗的难点是随着广谱抗生素的滥用、病人的依从性差，导致多重耐药菌株的大量出现。2007年2月美国《新科学家》杂志报道，意大利出现一例对所有已知的单一药物都具有抗药性的肺结核杆菌，被称为“极端耐药性肺结核杆菌”。2007年5月5日美国《华盛顿邮报》报道：一种对绝大多数药物都有耐药性的肺结核杆菌正在37个国家流行。患者不得不忍受“老三化”或者大量昂贵的二线药物的治疗，造成极大的不便。严峻的形势呼唤着新的药物靶点的出现和更多的对耐药菌有效地新型抗结核药物的问世。细菌中1)NA拓扑异构酶Ⅱ与细菌体内的DNA复制、转录、重组和修复等重要的生理过程都有着直接或间接的关系，为细菌生存所必需…1；同时拓扑异构酶Ⅱ不同于真核生物体内的拓扑异构酶Ⅱ，为细菌所特有，因此拓扑异构酶II是一个比较理想的药物作用靶点。筛选拓扑异构酶II抑制剂有可能获得高效低毒、与目前临床上常用的抗菌药物有不同作用机制、无交叉耐药的新型抗结核药物。拓扑异构酶II中存在两个亚基A、B。亚基A是喹诺酮类抗生素的作用靶点。’亚基B作为一个全新的抗结核药物筛选靶点“”有可能得到具有独特作用机制的新型治疗药物，并且能够克服喹诺酮耐药。国内外也尚未见相关的新型拓扑异构酶II抑制剂的报道。肖春玲教授以拓扑异构酶II的B亚基为靶点建立了抗结核药物的筛选模型，并筛选到103h系列菌株。103h系列菌株的活性物质对耐链霉素、异烟肼、利福平的菌株具有一定的抗性。我们对该系列中28个菌株发酵条件的初步考察以及发酵产物的初步筛选，挑选出菌株103h一02842。对该菌株发酵产物中的活性成分进行了分离纯化工作，得到了两个脂溶性组分A、B，对草分枝杆菌有一定的抗性。对于该菌株产生的水溶性活性组分的分离方法也做了初步的探讨，但未得到理想的结果。№“转位酶(磷酸一N-乙酰胞壁酸五肽转位酶，转位酶I)是细菌细胞壁合成过程中的一个催化酶“1。”1，可以催化细胞壁合成过程中肽聚糖的合成。尿苷肽2前言类化合物(uridylpeptides)是目前己知的一类Mr“转位酶抑制剂。解云英博士的工作证明我所的Sansanmycins属于尿苷肽类化合物，并从Sansanmycins混合物中分离了三个新的化合物，分别为Sansanmycin A、B、c。我的工作是进一步分离余下的次要组分，先后得到两个组分Sansanmycin D、E。经过结构鉴定，Sansanmycin D就是己知化合物Mureidomycin A；Sansanmycin E由于所得样品极其微量，所以只初步推测出可能的结构，还有待于进一步的验证。第一部分 实验材料与仪器第一部分放线菌103A-02842的筛选和抗生素103A-02842的分离纯化实验材料与仪器1．菌种：1．1发酵菌株：放线菌103A系列28支菌株，由本所重点实验室的肖春玲教授提供1．2检定菌t草分枝杆菌(MycobacteriumphleJ)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)11号，枯草杆菌(Bacillus subtilis)由本所重点实验室提供2．培养基2．1发酵培养基Ah 调节PH 7．0葡萄糖0．5％ 麦芽膏1％ 棉籽饼粉 1％ 酵母膏0．5％可溶性淀粉 2％ K21口O。0．05％ (N地)zS04 0．5％CaC03 0．3％ NaCl 0．1％后期由于棉子饼粉短缺，采用了同等剂量的棉子蛋白替代，造成放线菌103A一02842的草分枝杆菌的生物效价显著降低。2．2发酵培养基A2= 调节PH 7．O一7．5葡萄糖0．5％ 酵母膏0．5％ 蛋白胨0．5％ 牛肉膏0．5％玉米浆0．4％ 黄豆饼粉 l％ 可溶性淀粉 1％CaC03 0．4％ CoClz．6H20 0．002％2．3检定培养基： 调节PH7．O一7．5蛋白胨0．5％ 牛肉膏0．3％ 琼脂粉1．2％2．4硼斜面培养羞：酵母浸粉 49 麦芽浸粉lOg 葡萄糖49 琼脂粉2．5甘油液体培养基：加入大量的玻璃珠，调节PB7．O一7．5蛋白胨0．5％ 牛肉膏0．3％ 甘油 2％2．6 125骆文氏鸡蛋斜面培养基i 1000ml4第一部分 实验材料与仪器新鲜鸡蛋(15一16个) 625mi 2％孔雀绿液lOmlggS04．7H20 0．3759 I(}12P0。 1．59 天冬素 2．259甘油 7．5ml 土豆精(粉)18．89 H：0 375mi鸡蛋要纱布过滤，孔雀绿液滤膜过滤。83“C恒温1h，卜2天以后83“C再次恒温Ih。2．7肉汤培养基蛋白胨 19 牛肉膏0．59 NaCl 0．59肋 100ml PH 7．2肉汤固体培养基要加入209／L琼脂粉3．实验试剩甲醇、丙酮、氯仿、NaOH、(N}14)：c0。北京化工厂生产，均为分析纯色谱纯甲醇为FisherChemicals公司的产品0。5M PH7．0磷酸缓冲液4．分离纯化所用材料制备用硅胶层析板：Kieselgel 60 F254(Schichtdicke 0．5m)20．20cmMerck公司分析用硅胶层析板：Kieselgel 60 F254(Schichtdicke 0．25rm)20．20cmMerck公司4006大孔吸附树脂 南开大学精细化学实验厂1×3强酸性阳离子交换树脂 南开大学精细化学实验厂SP--Sephadex--C-25葡聚糖凝胶 中国医药集团上海化学试剂公司常压ODS层析色谱填料Polygoprep 60—50 C18 DIK姒公司分析色谱柱 GASUKURO KOGY0，250 X 4．6岫C185．主要仪器高效液相色谱仪：LG一10ATvp自动部分收集器：BSz—1005Shimadzu公司上海沪西仪器厂第一部分 实验材料与仪器旋转薄膜蒸发仪：Rotavapor真空冷冻干燥仪：-Iodulyo超净工作台电子天平电子分析天平梯度混合器：恒温摇床6BuCHI公司英国Edwards公司SANYO MCV—B161Sb(T)oHAUS Scout II舾TTLER AB204一ETB—1000上海统一五金机械修造社HZQ_Q恒温摇床第一部分 实验方法实验方法1．菌株发酵将相应的菌株接种到YM斜面培养基上，28。C恒温室培养7天，再用竹签接种到摇瓶(100ml／500m1)中，28。C摇床恒温振荡(220rpm)培养48小时。然后以10％的接种量接种到发酵培养基摇瓶中(100ml／500m1)，28。C摇床恒温振荡培养96小时。2．检定菌(草分枝杆菌的制备)草分枝杆菌接种到125骆文氏鸡蛋斜面培养基中，28。C恒温培养4天。接入装有大量由9ram玻璃珠的甘油液体培养基中，37℃摇床恒温振荡(170--180rpm)培养48小时。再在无菌条件下用无菌脱脂棉过滤，得到草分枝杆菌的菌液。绿脓杆菌11号从YM培养基斜面上接种到肉汤液体培养基中，37“(2过夜。枯草杆菌从YM培养基斜面上接种到肉汤液体培养基中，37。C过夜。3．生物检测采用平板纸片法，用由5mm的纸片浸取发酵液或提取分离过程中收集液，风干，置于接种1％草分枝杆菌的检测培养基平板(巾9cm平皿，15ml检定培养基)上，37。C培养12小时，观察有无抑菌活性。4．，帝选出发菌株、备用曹株4．1发酵峰值时问检嗣28个菌株常规发酵，分别于72h，9611、120h放发酵瓶。发酵液3000rpm离心15rain，菌丝用适量的丙酮浸泡，蒸除丙酮，活性成分与上清液合并。发酵液处理后用草分枝杆菌生物检定，根据抑菌圈的大小确定发酵峰值时间。4．2 8个涪媒系统的纸层析。(没有做第7组)1)水饱和的正丁醇；2)水饱和的正丁醇，内含有2％对甲苯磺酸；3)正丁醇：醋酸：水=2：l z 1：4)水饱和的正丁醇，内含有2％六氢吡啶；7第一部分 实验方法5)0．5M PH7．0磷酸缓冲液，用正丁醇饱和；6)正丁醇饱和的水，内含有2％对甲苯磺酸；7)苯：甲醇-----4：1，滤纸用0．5M PH7．0磷酸缓冲液处理(未做)8)75％甲醇，25％水(内含有3％NaCl)，滤纸用5％Na2S04事先处理。发酵液3000rpm离心16min，菌丝用适量的丙酮浸泡，蒸除丙酮，活性成分与上清液合并。滤纸条长15cm，上下端各为2、3cm，宽0．5cm。用毛细管取处理好的发酵液在滤纸点样，风干，重复点样30次以上，放入层析缸上行展开。层析结束后，自然风干除去有机溶剂，按照各组相应顺序扣置在检定平板上(150ml检定培养基，1％草分枝杆菌的含菌量)，37。C恒温过夜，生物显影，即可判断相关成分、极性。4．3初步抗菌活性检测处理后的发酵液，用纸片法分别检测对草分枝杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌11号的抗菌活性，初步确定抗菌活性。4．4 40∞大孔树脂对活性成分吸附情况的考察挑选对草分枝杆菌抗菌活性较好的几个菌株，发酵液处理后上4006大孔吸附树脂，用水、不同浓度的丙酮一水溶液洗脱，初步判断其极性。4．5出发菌株和备用菌株的选择综合上面的四种方法的结果，初步筛选出进一步工作的出发菌株和几个备用菌株。5．分离纯化发酵液上清液 菌丝体8适量丙酮浸泡，蒸除丙酮l o-5096丙酮水溶液梯度洗脱第一部分 实验方法中性乙酸活性洗脱液l真空减压浓缩，蒸除丙酮1x3阳离子交换树脂(N地+型)流出液水层 有机溶剂层J』氯仿：甲醇=lo：l“／v)紫外灯下刮板i乙酸乙酯再次溶解』J脂溶性组分A、B』』0．3N氨水洗脱I SP—Sephadex—c一25葡J 聚糖凝胶oDs中压柱』水溶性组分5．1腊溶性组分(1 X 3强酸性阳离子树脂的流出液)的薄层层析1X3强酸性阳离子树脂的流出液，用中性乙酸乙酯萃取2次，有机相减压浓缩。浓缩液在Merck公司的Kieselgel 60 F254(Schichtdicke 0．5m)制备板上点样，展开液为氯仿：甲醇=10：1(v／v)。吹净有机溶剂后，从层析板边上剪裁下一长条层析板，用草分枝杆菌生物显影。按照生物活性位置，结合层析板在紫外灯下的显影，刮下活性成分。粉末收集物再次用中性乙酸乙酯溶解，薄9第一部分 实验方法层层析，刮板。最终得到两个脂溶性组分，HPLC检验。5．2水溶性组分(1×3强酸性阳离子树脂的0．鲫氨水洗脱液)分离纯化方法的探讨对于水溶性组分，我们初步测定了其对草分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、耻垢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉菌的抗菌活性。先后采用了SP--Sephadex--C一25葡聚糖凝胶、ODS中压柱等方法对水溶性组分的分离纯化进行了尝试与探讨。